期刊論壇(三)讀書會
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[編輯] 緣起
這是一個"期刊論壇的讀書會"主要是針對目前生物期刊發行種類多樣且數量也龐大，憑一己之力量所能閱讀的文章有限，而自己獨自一人對於文章內容的解讀上也易產生迷思，因此想藉由多人閱讀生物期刊，且每人所喜好的主題有所差異下，而能達到短時間就能有多元化的知識刺激，而且這樣開放性的討論空間，讓在場的眾人提供自己的背景知識及腦力激盪，總能再延伸更多的想法與問題，這是個能讓對科學研究有興趣的人感到十分exciting。
[編輯] 內容
另外基於尊重著作權，所以下面所提到的期刊文章內容的圖表部分並沒有附上，但是文章都是高醫圖書館都有提供的期刊，請有興趣的人可按照所附的資訊去做檢索，謝謝。
(A)
Title Gambogic acid inhibits angiogenesis and prostate tumor growth by suppressing VEGFR2 signaling
Authors Tingfang Yi, Zhengfang Yi,
Source Cancer Res. 2008 March 15; 68(6): 1843–1850.
Why do? 藤黃酸（gambogic acid）是一種來自於南亞的藤黃屬植物( Garcinia hanburyi) 樹脂中萃取出的活性成分。先前研究指出，藤黃酸能夠抑制人類肝癌腫瘤的生長，但是機制目前仍不清楚。由於血管新生是腫瘤生成的一項重要過程，而血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是血管新生過程中不可缺少的因子，於是作者就懷疑藤黃酸是否會藉由抑制VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2)的訊息傳遞路徑，進而抑制血管新生，導致腫瘤無法增長或轉移。
How do? 作者首先測試藤黃酸是否能夠抑制人類臍靜脈內皮細胞的增生。接著在活體實驗中，作者注射前列腺癌細胞到SCID老鼠體內，使老鼠生長出一定大小的腫瘤之後，再注射不同濃度的藤黃酸給予治療，觀察腫瘤的大小、重量及血管新生的情形，，最後作者利用西方點墨法，偵測VEGFR2訊息傳遞路徑下游的FAK、c-Src和AKT激酶活性
Result (1) 以不同濃度的藤黃酸刺激人類臍靜脈內皮細胞，觀察細胞移行及管柱形成等情形。結果發現藤黃酸濃度越高，細胞移行及形成新生管柱的程度越低。表示藤黃酸能夠抑制內皮細胞的增長(Figure 1-B.C.D) (2) 作者注射前列腺癌細胞到SCID老鼠體內，使老鼠生長出一定大小的腫瘤之後，再注射不同濃度的藤黃酸給予治療，發現腫瘤的大小、重量及血管新生都有被抑制的現象。也就證明藤黃酸能夠抑制腫瘤的血管新生以及腫瘤的生成(Figure 3-A.B.C) (3) 作者利用西方點墨法，偵測VEGFR2訊息傳遞路徑下游的FAK、c-Src和AKT激酶活性。發現經過藤黃酸刺激之後，VEGFR2訊息傳遞路徑下游的FAK、c-Src和AKT激酶活性比控制組來的低，並有顯著差異，所以藤黃酸會抑制VEGFR2活化下游的激酶，使得訊息無法傳遞下去。(Figure 5-C)
Conclusion 經由以上實驗，作者證明了藤黃酸能夠藉由抑制VEGFR2的訊息傳遞路徑，進而抑制血管內皮細胞的移行及形成管柱的情形，也就能抑制血管新生，最後進一步抑制腫瘤的生長。而未來在腫瘤治療上，藤黃酸有潛力發展成一種有效的抗血管新生藥物。
(B)
Title Amelioration of insulin resistance in women with PCOS via reduced insulin receptor substrate-1 Ser312 phosphorylation following laparoscopic ovarian electrocautery
Authors Kok-Min Shew et al.
Source Human Reproduction Vol.22 No.4 pp. 1003-1010,2007
Why do? 做者想知道腹腔鏡卵巢電燒手術是否能藉由降低IRS-1 Ser312的磷酸化程度來有效的改善PCOS女性胰島素抑制的現象。並推測可成造成此現象的分子機制。
How do? 做糖類耐受性測試 分別抽取LOE前後的血液及脂肪細胞來做西方點墨法，並比較其Ser312、ERK、IRβ-subunit、GLUT-4和PI3-kinase的磷酸化程度再治療前後的差異。
Result (1) LOE治療前，PCOS患者兩個小時的葡萄糖含量，禁食的胰島素含量和兩個小時的胰島素含量與身材年齡相仿健康的人相比要來得高，而體內平衡模式胰島素抗阻標記(HOMAIR)和禁食的葡萄糖和胰島素比質(G0/I0)與身材年齡相仿健康的人相比要來得低。LOE三個月的治療後，血清的葡萄糖和胰島素含量有顯著降低，而G0/I0有明顯上升。 (2) 在PCOS的女性，胞外調節激脢(ERK)的活化程度比健康的人高但在LOE治療後有顯著的降低。 (3) PCOS患者的胰島素受器(IR)、GLUT-4和PI3-K的含量比對照組的低，但在LOE治療後有升高。 (4) 在PCOS患者，IRS-1 Ser312磷酸化的含量比對照組高，但在LOE治療後有明顯的降低，然而IRS-1在使酪氨酸磷酸化的含量比對照組低，但在LOE治療後有明顯升高。 在觀察研究中發現，這些結果都證實了在PCOS患者中，藉由LOE降低IRS-1 Ser312磷酸化程度能有效的減少胰島素的抗性。
(C)
Title Sensitive in vivo imaging of T cells using a membranebound Gaussia princeps luciferase
Authors Elmer B Santos, Michel Sadelain & Renier J Brentjens
Source NATURE MEDICINE VOLUME 15 NUMBER 3 MARCH 2009
Why do? luciferase enzymes被廣泛的使用在非侵犯性造影。其中Firefly luciferase (FFLuc)取自於Firefly Photinus pyralis，可被luciferin催化產生冷光，也被廣泛的使用。儘管FFLuc運用在in vivo已有效的偵測腫瘤細胞，但FFLuc對於從transgenic FFLuc+ mice、T cell hybridomas所取得的T cell populations的造影上仍有很大的限制。此外，比照腫瘤細胞與其他造血細胞，FFLuc在T cell的訊號是比較弱的。因此在這方面是有待研究人員去解決的。
How do? 作者使用人類化的GLuc enzyme，取自於copepod Gaussia princeps。作者將它表現於T cell，並且利用在T cell表面修飾tumor-specific chimeric antigen receptors (CARs)，可增加T cell專一性的聚集於腫瘤區域，以達造影的功效。
Result (1) 作者比較膜上Gluc與分泌型Gluc以及另一種luciferase，Rluc的signal強度，膜上Gluc的signal是最強的。 (2) 將膜上Gluc、分泌型Gluc、分泌型Rluc打入免疫缺陷的SCID老鼠中，發現膜上Gluc的signal最強，並且decay程度是最小的。 (3) 將Gluc表現於DO11.10 T cell上，並且將老鼠植入A20表現OVA的腫瘤細胞，再將表現Gluc的DO11.10 T cell打入老鼠體內。DO11.10 T cell會特異性的結合上A20腫瘤細胞且成功造影。 (4) 將human T cells表現Gluc與tumor-specific chimeric antigen receptors (CARs)，並打入有植入NALM6 tumors的老鼠中，此T cellc會因為CAR聚集於腫瘤區域，也可以成功的造影。
Conclusion 比較其他in vivo的T cell imaging，包括PET和MRI, bioluminescent imaging當作一個造影的形式是可被欣然接受的，花費上是可實行的，而且background很小並且可同時偵測兩種不同的cell populations。作者覺得這項新的技術可用來運用在primary T cells的造影上。
Discussion ※為什麼第三個實驗作者要另外用18FDG去做micro PET的造影？ 作者想看DO11.10 T cell在攜帶Gluc的情況下會不會影響T cell抑制腫瘤的能力。結果是”不會影響”，因為micro PET 顯示有表現OVA的A20腫瘤細胞的signal比沒有表現OVA的A20腫瘤細胞來的小，原因是DO11.10 T cell可特異性的結合上OVA並且抑制腫瘤大小。又因為18FDG主要是針對腫瘤細胞上醣受器的多寡，腫瘤越大，醣受器就越多，signal就越高。
(D)
Title Specific recruitment of protein kinase A to the immunoglobulin locus regulates class-switch recombination
Authors Vuong BQ, Lee M, Kabir S, Irimia C, Macchiarulo S, McKnight GS, Chaudhuri J.
Source Immunology, 2009. 10:420-426.
Why do? 了解AID在CSR中對substrate的作用相關機制。 1. AID在B細胞中能夠只作用在特定的Ig gene區域的機制仍未明，在先前對於此機制的其中一種假設為: AID由特定factor或complex帶到其substrate，而對於作用的target的選擇性則由此factor/complex提供。 2. 由先前的研究中，已知AID可被PKA (protein kinase A)磷酸化，此種修飾目前所知道會造成的結果，只有影響AID和RPA (replication protein A)間的交互作用。而AID-RPA complex已知會在transcription中的variablegene穩定ssDNA，使AID可以進行deamination。 假設: PKA藉由影響AID的磷酸化調控RPA的recruitment，進而影響CSR。
How do? ChIP配合PCR或qPCR
ResultFigure 3a: ChIP + PCR 由此實驗結果可證實AID、RPA以及PKA可在S region形成complexFigure 5b: 藉由RI alpha B:Cd21-Cre轉殖鼠，證實當AID無法被PKA磷酸化時，則CSR會減少。此品系的Tg mice其PKA的RI alpha無法與cDNA結合並離開C alpha，因此無法催化AID。 Figure 5c: ChIP + qPCR，此實驗結果可得兩個重點：(a) AID及PKA可各自與S region結合，即使是未被磷酸化的AID或是在AID KOmice的PKA皆不會被影響與S region的結合能力。(b) AID無法被PKA磷酸化時，RPA無法被帶到S region。
Conclusion 作者以ChIP的方式確認了AID在被磷酸化之後可與RPA同時存在於S region。
Discussion PKA與AID同時存在S region時，AID可在局部被磷酸化，使RPA進入S region。 之後RPA可穩定ssDNA使AID可以有足夠的時間在此段gene造成密集的deamination。另外也可能由RPA帶來UNG等，進行mutagenic repair，造成dsDNA斷裂，進行CSR。
(E)
Title Antigen-specific human polyclonal antibodies from hyperimmunized cattle
Authors Kuroiwa Y, Kasinathan P, Sathiyaseelan T, et al.
Source Nat Biotechnol. 2009; 27(2):173-181.
Why do? Therapeutic antibodies could be useful for many human diseases. For example, Herceptin can block HER2/neu to inhibit growth of breast cancer. In previous studies, the researchers discovered a therapeutic antibody useful for treating disease in mice. But this mouse antibody must be humanized first before it can be used in human. In addition, antibodies become nonfunctional after humanization. Other researches have previously developed transgenic mice (XenoMouse) that can produce full human antibody. But, mice are too small, unsuitable for producing practical amounts of therapeutic human antibodies.
How do? In this paper, the authors established a transchromosomic (Tc) cattle that can produce large amounts of human polyclonal antibodies (hpAbs).
Result The authors knocked out the bovine antibody loci (IGHM, and IGHML1) and replaced with the human antibody loci (hIGH , and hIGκ). They found the Tc cattles can produce up to ~650μg/ml fully human antibody (hIgG/hκ) in plasma. Furthermore, Tc cattle-produced hIgG/hκ maintains glycosylation similar to human antibodies. Finally, the authors demonstrated that the purified Tc cattle-produced hIgG/hκ can neutralize cytotoxin antigens such as anthrax protective antigen (PA) in vitro, and in vivo.
Conclusion In summary, these authors developed a hpAbs-producing cattle to synthesis clinical therapeutic antibodies. These Tc cattle may expand clinical application of antibody-based therapeutics.
Discussion The hpAbs-producing cattle may produce fully human antibodies to neutralized cytotoxin, such as snake venom or pathogen. These cattle may be a method to quickly and larger produce clinical therapeutic antibodies. In addition, the hpAbs, produced from Tc cattle, may cause lower immune-response than other source, such as CHO cell system. The Tc cattle may be a new and better method to synthesis clinical therapeutic antibodies.
(F)
Title Targeted Gene Inactivation in Zebrafish Using Engineered Zinc-finger Nucleases
Authors Meng, X., Noyes, M.B., Zhu, L.J., Lawson, N.D. & Wolfe, S.A.
Source Nat. Biotectnol. 26, 695-701 (2008)
Why do? 現今遺傳學的研究，一般可以分成Classical genetics與Reverse genetics，而Reverse genetics意指在知道基因序列後利用抑制該基因表現的方法來觀察特定基因與某表型的關係。然而特定基因序列的抑制操作在大多數脊椎動物的模型中還不是那麼容易執行，因此作者想研發出一種能在特定基因序列執行抑制操作的方法。
How do? 在斑馬魚的細胞株中，若使用ZFNs (Zinc-finger nucleases)的情況下將可以損害特定的基因序列。ZFNs可以造成DNA的雙股斷裂(Double-strane brake)，而在DNA經過雙股斷裂後體內修補機制將會走向Nonhomologous end joining，將DNA重新接起來，雖然DNA被重新接了起來但是在接合位會發生Insertion Deletion，也就是造成了突變。而作者的目的就是利用ZFNs在斑馬魚(Zebrafish)的體內產生特定基因序列的突變。作者首先利用基因工程的方法，將ZFNs經過重組並改造出可以辨認斑馬魚體內的kdr序列，而kdr序列可轉錄出血管內皮新生因子2的受體(Vascular endothelial growth factor-2 receptor)。最後將會轉錄出ZFNs的mRNA給注射到處於一細胞胚胎階段(One-cell-stage)的斑馬魚胚胎細胞體內，看看斑馬魚到底會不會受到影響。
Result (1)在將會轉錄出ZFNs的mRNA給注射到處於一細胞胚胎階段(One-cell-stage)的斑馬魚胚胎細胞體內後，將會導致特定基因序列的突變性損害。 (2)而這種突變同時很高的機率會遺傳到下一代。
Conclusion (1)ZFNs 可以藉由基因工程的方法去辨認任何的基因序列。 (2)這種突變方法在斑馬魚體內有相當穩定的突變率。 (3)這種突變方法可以穩定的遺傳給子代。 (4)這種突變方法應該可以使用在其他種脊椎動物上。
Discussion (1)作者認為將這種突變方法使用在其他種脊椎動物上是下一個要努力的目標。 (2)作者認為若能進一步使用homologous recombination的技術，將可以達到的knock-ins目的。
[編輯] 參與心得
很高興有機會能夠参與這個讀書會，畢竟不斷的吸收新知、學習新的一切是很重要的，特別是在生物醫學這個領域，飛快的進步，如果不一直往前就會變成退步，所以這種閱讀論文的讀書會對我格外重要。而藉由讀書會的方式，每個人都個別去閱讀自己的選定的論文，仔細熟讀，再去找背景資料，用最簡單明瞭的方式報告，使與會的每個人都可以很快的了解全新未接觸的論文，而省去閱讀的時間；往往自己讀一篇論文就需要花個幾天，但藉由這個讀書會可以簡單的用五到十分鐘就可以了解，而且一次讀書會就可以聽很多篇，之後再稍微讀過一下論文，就可以很快掌握重點。並且可以藉由這個讀書會，利用大家的力量逼迫自己要去閱讀新的論文，練習掌握重點，如何才能將一篇長長的論文，簡化成五分鐘或是十分鐘的報告，而且還要清楚的表達，這真是個需要長時間練習的大課題。而我想一個小小的讀書會真的能做到很多吧，畢竟一個人孤軍奮戰總是有點難，當多幾個人一起努力，本來知道該去做卻一直沒去做的事情會更容易可以達成，而且也多了互相扶持、互相督促的力量，如果有不懂的地方，也可以藉由詢問學長姐得到解答，或者互相討論，學習如何自己解決問題。讀書會真的蠻重要的，希望大家一起讀書、一起成長。
