期刊論壇(一)讀書會

出自KMU Wiki

緣起

這是一個"期刊論壇的讀書會"主要是針對目前生物期刊發行種類多樣且數量也龐大，憑一己之力量所能閱讀的文章有限，而自己獨自一人對於文章內容的解讀上也易產生迷思，因此想藉由多人閱讀生物期刊，且每人所喜好的主題有所差異下，而能達到短時間就能有多元化的知識刺激，而且這樣開放性的討論空間，讓在場的眾人提供自己的背景知識及腦力激盪，總能再延伸更多的想法與問題，這是個能讓對科學研究有興趣的人感到十分exciting。

內容

另外基於尊重著作權，所以下面所提到的期刊文章內容的圖表部分並沒有附上，但是文章都是高醫圖書館都有提供的期刊，請有興趣的人可按照所附的資訊去做檢索，謝謝。

''((A))''

Title Efficacies of inactivated vaccines against betanodavirus in grouper larvae (Epinephelus coioides) by bath immunization

Authors Yu-Hsuan Kai, Shau-Chi Chi

Source Vaccine (2008) 26, 1450—1457

Why do? 病毒性神經壞死症病毒(Viral nervous necrosi virus, NNV)是種能感染大於34種養殖魚(含海水及淡水魚)，並會造成魚苗高致死率達80-100%。現今在NNV vaccine的免疫方式是以肌肉內注射(intramuscular, IM)或腹腔內注射(intraperitoneal, IP)兩種方式為主，這容易造成魚苗壓力及耗人力，所以開發非注射型免疫方式是作者的目標。另外，石斑魚是台灣在內需或外銷上很重要的高經濟價值魚苗。

How do? 利用formalin或binary ethylenimine(BEI)處理NNV，得到失活化病毒疫苗在不同的實驗設計(請見期刊中的Fig. 1)下去免疫魚苗，並對免疫過的魚苗進行攻毒測試看看失活化病毒疫苗的功效如何。

Result (1) 每組100隻石斑魚苗(體重 0.2g；身長 2.4cm)以不同處理但病毒量相同(107 TCID50/ml)的失活化病毒溶液(0.1% formalin (F-I)、0.2% formalin (F-II) 和 4mM BEI)浸潤魚隻120分鐘後，並在免疫後30天對魚隻進行攻毒。結果顯示，用BEI處理的失活化病毒疫苗相較於formalin處理的失活化病毒疫苗有較低的累積死亡率，並且在統計分析上有顯著性的差異(請見期刊中的Fig. 2)。 (2) 另外作者引入奈米包膜技術，將失活化病毒疫苗包膜化後去免疫魚苗。結果發現包膜可以改善formalin處理的失活化病毒疫苗的免疫效果，降低魚苗攻毒時的累積死亡率，並且在統計分析上有顯著性的差異(請見期刊中的Fig. 5)。 (3) 魚隻經由BEI處理的失活化病毒疫苗免疫後15、30、90天，再以浸泡(bath)或肌肉內注射 (IM)的方式進行攻毒測試。可看出以失活化病毒疫苗免疫後15天的組別相較於30天或90天的組別累積死亡率偏高(43% VS 13%, 10%)，且相對存活百分率(relative percent survival, RPS)偏低(30 VS 87, 82)，這意指15天還不足以讓幼魚發展出完整的免疫能力去抵抗NNV的感染。不過以IM的攻毒方式在90天的組別RPS也降低到8。

Conclusion (1) 雖然臭氧可以用來消毒受精卵以達到控制VNN的感染，但其安全劑量隨物種的改變而有所不同，因此在實際的應用上仍有困難。目前，為有效控制魚病毒感染，免疫法還是較能夠被廣泛接受。此篇paper將浸泡免疫法(bath immunization)應用於40 dph (days post-hatch)石斑魚上，此時期的魚形態雖小但其免疫器官已發展完成。 (2) 大部分魚疫苗是靠傳統的方法藉由複雜的純化步驟才可得到，而此方法只需直接從受NNV感染的GF-1細胞的上清液獲得即可。 (3) 大部分的魚疫苗製備其失活性的抗原是藉由formalin，但近年來，BEI在應用上因其不會與蛋白質反應的被認為更優於formalin，在此篇paper中也同樣證實了利用BEI去活化NNV引起免疫效果的能力優於formalin。 (4) 在此篇paper，又應用了另一種新技術，將NNV疫苗奈米包膜化。將NNV疫苗與氫化植物油和其他元素混合處理產生奈米包膜顆粒。因氫化植物油的排水和排氧的特性可增加疫苗的穩定性以保存疫苗，此包膜化疫苗的高穩定性使得此疫苗可藉由魚的體表或躲過胃酸的破壞而由消化道進入魚體內。 (5) 相較於之前的paper，betanodavirus皆被測試於青年或成年時期的魚，而此篇paper還指出利用BEI失活性病毒疫苗即可在魚晚幼年時期及早青年時期大量減少其死亡。

Discussion (1) 為什麼以浸潤的免疫方式能達到免疫的效果？ a. 可能是失活化病毒疫苗透過水的媒介，經由魚的黏膜或是食道甚至是鰓等途徑來造成免疫效果。 b. 如：成大 楊惠郎教授藉由表現GNNV鞘蛋白的E. coli餵食豐年蝦，之後再將豐年蝦餵給石斑魚苗吃，即可達到免疫魚隻的效果。台大 陳秀男教授利用NNV死毒疫免免疫雞隻，雞會生產具有抗NNV抗體的雞蛋，而這樣的雞蛋餵食魚苗亦可達到功效。因此，透過魚隻進食疫苗而產生免疫能力是種可參考的免疫方式。 c. 另外魚隻能由進食而有免疫能力或許並不是魚隻本身自己產生的，而是其消化道內的細菌會分泌抗病毒物質，Yoshimizu (2003)在魚隻消化道內分離到具有可中和BFNNV的細菌株，細菌單株化培養後加入魚飼料中餵食也可達到防疫的效果。

''((B))''

Title Secretory delivery of heterologous proteins in attenuated Vibrio anguillarum for potential use in vaccine design

Authors Lingyun Zhou. Qin Liu. Qiyao Wang. Yue Ma. Yuzhou Xu. Zhao Yang. Yan Zhao. Yuanxing Zhang

Source Appl Microbiol Biotechnol (2008) 79, 1027—1034

Why do? 目前已廣為大家接受的概念--利用減毒的致病菌表現多個外來蛋白質確能達到疫苗效果,而細菌表現蛋白質的位置主要有三:細胞內、細胞上及細胞外,作者認為若能將多個蛋白質表現到細胞外,將能達到最好的疫苗效果。

How do? 作者選用四種不同的細菌分泌訊息胜太: 來自E.coli的hemolysin, V.cholerae的RTX, 來自V. anguillarum的hemolysin及V. anguillarum的Zinc-metalloprotease以這四個系統來觀察減毒的V. anguillarum strain MVAV6203將綠色螢光蛋白(GFP)分泌到細菌外的能力。

Result (1) 作者將單純減毒菌與四組帶有不同分泌胜太的減毒菌培養後，於30C以IPTG誘導蛋白質表現3小時，並以10000g離心10分鐘，分離上清液及菌體，接著以抗GFP抗體偵測細胞培養基中與菌體內的GFP量。由結果圖1B可見，於培養基中，Zinc-metalloprotease的分泌胜太有很高量的GFP，證實Zinc-metalloprotease分泌胜太能將蛋白質分泌到細菌外。 (2)另外，為了證實此分泌胜太不受限於所分泌的蛋白質種類，所以，作者將GFP置換為EseB(愛德華菌的異質性蛋白質，能作為愛徳華氏症的疫苗) ，經由ELISA或西方點默法的測試，於結果圖4顯示，V. anguillarum的Zinc-metalloprotease (EmpA)的分泌胜太確實能將EseB分泌到細菌外。

Conclusion (1) 功能性的訊息胜太能將抗原直接傳送到細菌外，於蛋白質傳送功能中扮演重要角色。 (2) 本篇作者利用四種不同胜太，研究V. anguillarum將蛋白質傳送到細菌外的能力，結果證實只有EmpAs能有效率地將蛋白質分泌出去，其餘分泌胜太可能因異種，造成細胞內蛋白質的衰退(degradation) ，造成低的蛋白質表現與差的蛋白質分泌。而作者所選用的V. anguillarum則適合利用EmpA的分泌訊息胜太，來達到預期分泌效果。 (3) 若我們也想利用E.coli或salmonella當作減毒疫苗，或許也可考慮不同的革蘭氏陰性菌分泌性訊息胜太，不須考慮太多細菌不同分泌系統所須的各種組成，將能節省很多人力、物力的浪費。

''((C))''

Title Tumor-specific Activation of Human Telomerase Reverses Transcriptase Promoter Activity by Activating Enhancer-binding Protein-2 in Human Lung Cancer Cells

Authors Wu-Guo Deng, Gitanjali Jayachandran, Guanglin Wu, Kai Xu, Jack A. Roth, and Lin Ji

Source (2007) J. Biol. Chem. 282, 26460-26470

Why do? 在癌細胞中，端粒不會隨著細胞分裂而縮短，而在人類肺癌細胞中，AP-2β(activating enhancer-binding protein-2)被懷疑可以活化hTERT(Human Telomerase Reverses Transcriptase)使端粒延長，所以作者想證明在人類肺癌細胞中，若是抑制AP-2β，是否可以使端粒縮短，進而導致細胞凋亡。

How do? 先證明AP-2β是否可以活化hTERT，使端粒酶活性升高，再利用siRNA抑制AP-2β，使hTERT不活化，觀察是否會導致端粒縮短以及細胞凋亡。

Result (1) 作者利用immunoprecipitation的方法，分別將hTERT probe和作為control的nonspecific probe接上biotin，再加到正常細胞與人類肺癌細胞中，再用streptavidin-bead將整個probe沉澱下來，利用western blotting的方式，用anti-AP-2β抗體去染，發現只有在人類肺癌細胞中hTERT probe可以與AP-2β結合(Fig.2A)。 (2) 正常細胞與人類肺癌細胞分別都有AP-2β被siRNA抑制以及沒有抑制AP-2β的組別，作者利用Telo TAGGG telomerase PCR ELISA的方法，先將各組的端粒片段接上DIG，用PCR放大後染上螢光，螢光會接在所有的DIG上，再利用ELISA測量螢光量，發現AP-2β沒有被抑制的癌細胞端粒酶活性較其他都高出許多，而正常細胞不管AP-2β是否被抑制皆沒有影響(Fig.6A)。 (3) 利用trypan blue exclusion assay將死亡的細胞染色，計算存活的細胞數量，發現在正常細胞中不論是否利用siRNA將AP-2β降解，細胞生存比例皆接近100%；在人類肺癌細胞中，AP-2β沒有被siRNA 降解的癌細胞生存率也接近100%，但是，AP-2β被siRNA 降解後，癌細胞生存率明顯的下降(Fig.6B)。

Conclusion (1) 證明了AP-2β在人類肺癌細胞中與hTERT promoter有tumor-specific binding。 (2) 證明在人類肺癌細胞中，AP-2β可以活化hTERT，使端粒酶活性升高。 (3) 證明將人類肺癌細胞中的AP-2β抑制，可以使人類肺癌細胞凋亡。

Discussion (1) 利用抑制人類肺癌細胞中的AP-2β是否會對人體產生副作用？ →在第三個實驗中證明，在正常細胞中不論是否利用siRNA將 AP-2β降解，細胞生存比例皆接近100%，表示抑制了AP-2β並不會對人體其他細胞產生傷害，產生副作用的機率非常低。

''((D))''

TitleOral delivery of DNA construct using chitosan nanoparticles to protect the shrimp from white spot syndrome virus (WSSV)

AuthorsS. Rajeshkumar, C. Venkatesan, M. Sarathi, V. Sarathbabu, John Thomas, K. Anver Basha, A.S. Sahul Hameed

Source Fish & Shellfish Immunology (2009)

Why do?在水產養殖中，蝦類養殖是一項高經濟價值的產業，在1987年時，台灣的養蝦產業到達巔峰，創下年產量九萬五千公噸的紀錄，也為台灣贏得了養蝦王國的美稱，但在1988年，外來傳染疾病迅速在國內蔓延，造成蝦類大量死亡，台灣的養蝦產業從此一蹶不振。蝦類的傳染疾病當中，白點症病毒(WSSV)為最嚴重的傳染病之一，它具有高傳染性、極高死亡率的的特性，一旦入侵養殖池，三四天內所有的蝦子均會死亡，因此被政府列為重點防制項目之一，目前已有文獻提出，WSSV的外膜蛋白VP28對於病毒感染蝦子扮演了極重要的角色，若能阻止病毒表面的VP28蛋白與蝦子的細胞表面分子結合，可大幅減少病毒的感染率。蝦子為無脊椎動物，其免疫系統不如脊椎動物來得完善，僅能依賴吞噬性細胞以及分泌抑菌胜肽抵抗外來病菌，而且無脊椎動物不像脊椎動物的免疫系統一樣具有記憶性，能在下一次遇到相同病菌時提早產生免疫反應來保護自己，因此在研究蝦類疫苗時，持久性不夠是一個很大的問題。

How do?本篇論文的作者以基因重組技術將病毒外膜蛋白VP28製作成質體，再利用甲殼素奈米包覆此質體，混入飼料中給蝦子食用，一段時間後加入活的WSSV病毒觀察蝦子的存活率及感染情形。

Result餵食疫苗後七天接觸病毒的蝦子，在每組三十隻的蝦子中存活率達到了百分之九十，而對照組全數死亡；在餵食疫苗後十四天接觸病毒的蝦子，其存活率仍有百分之七十六點六；在餵食疫苗後三十天接觸病毒的蝦子，存活率竟然超過了百分之五十，此實驗的結果證明了，利用甲殼素奈米包覆DNA可成功的刺激無脊椎動物產生免疫反應(在作者先前的研究中已經證明此甲殼素奈米疫苗可使脊椎動物產生免疫反應)，達到保護蝦子對抗WSSV感染的目的，大幅的提高了生存率。

Conclusion&Discussion目前養殖漁業幾乎都採用高密集式的養殖池，所以一旦爆發感染只能放棄整池的養殖物，目前對於蝦子的傳染病缺乏有效的疫苗，且沒有發展出抗病株的蝦子可供養殖，因此對於養殖蝦遭到傳染病的危害一直都只能被動的去做善後的動作，而不能在傳染爆發前就馬上阻止其散佈開來。以目前蝦類疫苗的文獻發展來看，以人工方式注射疫苗的保護率最高，但是在高密集的養殖池中實在既耗時又耗費人工，完全不符合經濟效益，若能以混入飼料口服方式，或是與能產生抑制病菌的其他種生物共養，才能在保護蝦子不受傳染病危害的同時兼顧經濟效益。