分析化學讀書會

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高雄醫學大學 讀書會 成果報告表

聯絡人：鄭智源 主題：以高效率液相層析儀螢光偵檢器分析及定量蝦廢棄物蛋白質中的色胺酸及酪胺酸

書(篇)名：High-performance liquid chromatography with fluorescence detection for quantitation of tryptophan and tyrosine in a shrimp waste protein concentrate (Journal of Chromatography B, 863 (2008) 88–93)

參與人數總計：12 討論時數總計：6

目錄 1 一、氨基酸結構：[1] 2 B.酪氨酸Tyrosine(Tyr)Y: 3 二、酪氨酸(Tyrosine)： 3.1 多巴胺 4 三、色氨酸(tryptophane) 5 四、蛋白水解步驟： 6 五、實驗步驟： 7 六、結論

一、氨基酸結構：[1]

A.色氨酸Tryptophan(Trp)W :

1.側鏈不溶於水(脂溶性)

2.為胺基酸中分子量最大者(204道爾頓)

3.芳香族之必需胺基酸

4.可以用來合成維生素的NAD+

5.植物生長荷爾蒙口引口朵乙酸

6.神經傳導物質Serotonin及生物時鐘調節物質melatonin

7.在A280有強的光吸收,

8.為必需氨基酸

9.60mg Trp可以合成1mg 菸草酸3

B.酪氨酸Tyrosine(Tyr)Y:

1.在pH=7 側鏈親水性但不帶電荷

2.含-OH基故略為極性,為很多酵素活性中心

3.由OH基與磷酸根形成磷脂鍵,也是Protein磷酸化的部位

4.蛋白質碘化為碘加在酪氨酸上,為放射免疫學的方法

5.酪胺酸在A275有強吸光

6.為非必需氨基酸(protein在A280吸光,主要由三個芳香族a.a.有關,其吸光大小 色氨酸>酪胺酸>苯丙胺酸)

C.必須胺基酸,非必需氨基酸:在人體需要的 22 種胺基酸中，有 8 種胺基酸是體內無法自己合成，必須靠體外補充，稱為『必須胺基酸』， 體內可以合成為非必需胺基酸

二、酪氨酸(Tyrosine)：

1.它是腦中神經傳導物之一，可協助克服憂鬱、改善記憶。促進甲狀腺，腎上腺及腦下垂體之功能。

2.肉類中含有豐富的蛋白質，蛋白質其中的一種必需的氨基酸－酪氨酸(Tyrosine)經腸道吸收後，隨血液循環至腦部，會合成神經傳遞物－多巴氨〈Dopamin〉及正腎上腺素〈Norepinephrine〉

3.此兩種物質都是負責思考敏捷及應付緊急狀況的重要物質。使血壓上升、體溫增加、精神興奮，睡意全消。

4.多巴胺、正腎上腺素和腎上腺素都是神經傳導因子。體內合成這些神經傳導因子的步驟，首先是一個反應速率控制的步 驟，由酪胺酸 (tyrosine) 氫氧化成 L-多巴 (L-dopa)；接著L-多巴失去二氧化碳形成多巴胺 (dopamine)；多巴胺再氫氧化就生成正腎上腺素 (norepinephrene)；正腎上腺素可以再進一步甲基化變成腎上腺素 (epinephrene)。這些反應步驟都需要enzyme的催化。 （圖二）[2]

多巴胺

被認為只是合成另一個神經傳導因子正腎上腺素的一個前驅物。他研發出一個具高敏感度的方法，可以分析多巴胺的量，結果發現多巴胺的量在腦部的某些區域，比正腎上腺素的量還要高，於是他推斷多巴胺本身也是一個神經傳導因子。腦部多巴胺的量特別高的區域是在基底神經節 ( basal ganglia)。

• 2000 年諾貝爾生理或醫學獎瑞典哥生堡 (Gothenburg) 大學的名譽退休教授卡爾生 Arvid Carlsson

三、色氨酸(tryptophane)

1.色氨酸是人體必需的氨基酸之一，色氨酸會轉換成與調節睡眠有關的神經傳遞物質－血清素〈Serotonin〉使飯後產生飽足感及誘發睡眠。

2.血清素〈Serotonin〉:腦細胞會分泌一種俗稱快樂荷爾蒙的血清素(serotonin)，血清素的分泌代謝正常時，就會有足夠的抗壓及情緒調節能力，當人體處於黑暗的狀態下，腦內的血清素就會轉化為褪黑激素(melatonin)，由腦下垂體分泌出，如同一個指令般的吩咐人體進入睡眠狀態，這就是人們到了晚間，就會自然入眠的原因，一旦天亮了，人體在接受光照後，就會停止分泌褪黑激素，而白天的血清素分泌量也會比較高，讓人體有更多的活力迎接生活的挑戰。

精神疾病與腦神經內分泌、神經傳導介質相關。現今，西醫之精神神經內分泌學中，最常提出的有：GABA（r-氨基丁酸）、ACTH （促腎上腺皮質激素）、Acetylcholine（乙醯膽鹼），與Choline（膽鹼）、Dopamin （多巴安）、Serotonin（血清素-5-羥色氨）、Melatonin（褪黑激素）、Prolactin（泌乳激素）、LH（在女性為黃體生成激素）、TSH（甲狀腺分泌激素）、GH（生長荷爾蒙）。在精神醫學界早期來講，都以T4 與TSH 來當研究對象，一直到哈里遜內科學，還是以T4 與TSH 之血中濃度為研究對象。大約十年前開始，至今，Serotonin 才成為研究對象。

Serotonin 異常所引起的症狀，比較接近中醫的甘麥大棗湯證，或是黃連阿膠湯證、歸脾湯證、半夏厚朴湯證。Serotonin 是放鬆心情，寧心安神，像小孩在媽媽胸懷的感覺，影響睡眠的比較多，Serotonin 不足者較偏向甘麥大棗與半夏厚朴湯合方，或半夏天麻白朮湯加甘草、龍眼乾。過亢者屬知柏地黃湯、或柴胡龍骨牡蠣湯證。 Melatonin 是調整生理時鐘，即時差的適應，見到太陽下山就想睡覺；或北極熊的冬眠皆與Melatonin 相關。在中醫較偏向於人參、十全大補、右歸飲、腎氣丸、斑龍丸、各種核（堅）果、蛋黃、魚卵、肝的範圍。 Dopamin 不足的，較偏向補腎陽兼活血化瘀，甚者，更兼寒瘀，例如：補陽還五湯或七保美髯丹加人參、川七、附子、乾薑、黃芩；或腎氣丸、右歸丸、十全大補湯（人參、丹參同用）加鹿茸、川七、乾薑、附子、黃芩，用玉桂，或參附湯、補腎丸。過亢的屬陽亢或陽越。

（1）腦部的神經傳導物質─血清素（serotonin)的形成 ： 色胺酸(tryptophane) 由人體從食物攝取會先轉化為5-羥基色胺酸(5-Hydroxy Trptophan:5-HTP），然後進入腦細胞後，才會再轉化為情緒控制荷爾蒙─血清素(serotonin) <圖三> [3] *Murch S.J.,KrishnaRaj S., Saxena P.K.(2000) Plant cell Reports 19,698-704

四、蛋白水解步驟：

(a)鹼水解樣品100-125℃在空氣中16-20小時

(b)稀釋水解樣品(非冷卻的HCl)用層析buffer

(c)將水解物澄清

(d)HPLC分離

(e)分光儀或氟儀器偵測

五、實驗步驟：

1.樣品製備： 將絞碎蝦殼廢棄物在30℃發酵36h再經離心(沉澱物)得到幾丁質沉澱物和蛋白質液,將蛋白質液凝聚乾燥

2.萃取酪胺酸及色胺酸： 從乾燥物品經酸雖水解,sample,25mg經(酸液水解)+超音波2min->0.5mg/ml

3. 水解蛋白： sample+4.2M NaOH(超音波兩分鐘)->去除N2加熱120℃ 4H->冷卻再用HCl調到pH9 , 在抽氣過濾 ,取液體加入borate buffer到50ml,取5ul進行HPLC分析

六、結論

A、HPLC separation and identification 最佳條件 a.Moblie phase：CH3OH:40mM sodium acetate buffer pH 4.5 (20:80) b.optimal wavelength: tyrosine:(λex = 274 nm ,λem = 304 nm) for 5.8 min tryptophan:(λex = 280 nm and λem = 348 nm) for 5.8 min Column temp:26℃ flow rate:0.80 mL/min column Exil ODS column with a particle size 5m

B、HPLC分析圖: <圖四>[4] Tryptophan peak 8.32 ±0.02min tyrosine peak 4.25±0.01min

C、Optimum conditions of alkaline hydrolysis of protein （圖五）[5] 1. 以NaOH volume (3,6,9ml),hydrolysis time(4,8,12,16h)針對樣品25mg找最佳反應;NaOH濃度4.2N 2.These results indicated that 4 h of hydrolysis time at 9mL of 4.2N NaOH is adequate for complete hydrolysis of proteins, 3. 4 h of hydrolysis time and 3mL 4.2N NaOH were chosen for further works

D、方法確認： The relationship between concentrations and peak area were always linear, with coefficients of determination greater than 0.999. （圖六） [6]

E、for the total of the tyrosine and tryptophan, was researched by analyzing the same sample, and the RSD was found to be 2.16% (3.83g/g dry mass, n = 8) for tryptophan and 1.86% (12.96g/g dry mass, n = 8) for tyrosine. The overall relative standard deviations (RSDs) （圖七）[7]

F、presents the recovery percentages obtained to free tryptophan and tyrosine. During the recovery for total tryptophan and tyrosine, eight concentrated powdered protein samples from fermented shrimp waste were spiked with a known concentration (1.56 mg/g dry mass and 3.85 mg/g dry mass) before hydrolysis, extraction, and quantitation. The recovery for total tryptophan and tyrosine was 90.50% (7.38% RSD) and 95.9% (2.33% RSD), （圖八） [8] G、Tryptophan and tyrosine (free and total) contents in a protein concentrate from fermented shrimp waste A、the tyrosine content was higher than the tryptophan contentcontent B、total tyrosine (10.78±2.00 mg/g dry mass) C、Total tryptophan (3.65±0.46 mg/g dry mass) in freeze-dried samples D、the tryptophan is a limiting factor in protein E、the free tyrosine and tryptophan mean contents were, respectively,approximately 67% and 74% F、the shrimp waste is deproteinized by proteolytic enzymes produced by the added microorganisms G、This is achieved during the enzymatic deproteinization of the shrimp waste by the action of the microorganisms （圖九） [9] 七、Conclusions： HPLC偵測蝦殼廢棄物中protein的tryptophan & tyrosine為目前最簡單,快速,準確,可靠性,檢測樣品只需要少量的體積這方法應用生化及營養研究