以高效率液相層析儀螢光偵檢器分析及定量蝦廢棄物蛋白質中的色胺酸及酪胺酸

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高雄醫學大學 讀書會 成果報告表 編 號： (由審核單位填寫) 讀書會名稱：分析化學讀書會 聯絡人：鄭智源 主題：以高效率液相層析儀螢光偵檢器分析及定量蝦廢棄物蛋白質中的色胺酸及酪胺酸 書(篇)名：High-performance liquid chromatography with fluorescence detection for quantitation of tryptophan and tyrosine in a shrimp waste protein concentrate (Journal of Chromatography B, 863 (2008) 88–93) 參與人數總計：12 討論時數總計：6 一、氨基酸結構：[1] A.色氨酸Tryptophan(Trp)W : 1.側鏈不溶於水(脂溶性) 2.為胺基酸中分子量最大者(204道爾頓) 3.芳香族之必需胺基酸 4.可以用來合成維生素的NAD+ 5.植物生長荷爾蒙口引口朵乙酸 6.神經傳導物質Serotonin及生物時鐘調節物質melatonin 7.在A280有強的吸光, 8.為必需氨基酸 9.60mg Trp可以合成1mg 菸草酸3 B.酪氨酸Tyrosine(Tyr)Y: 1.在pH=7 側鏈親水性但不帶電荷 2.含-OH基故略為極性,為很多酵素活性中心 3.由OH基與磷酸根形成磷脂鍵,也是Protein磷酸化的部位 4.蛋白質碘化為碘加在酪氨酸上,為放射免疫學的方法 5.酪胺酸在A275有強吸光 6.為非必需氨基酸 (protein在A280吸光,主要由三個芳香族a.a.有關,其吸光大小 色氨酸>酪胺酸>苯丙胺酸) C.必須胺基酸,非必需氨基酸:在人體需要的 22 種胺基酸中，有 8 種胺基酸是體內無法自己合成，必須靠體外補充，稱為『必須胺基酸』， 體內可以合成為非必需胺基酸

二、酪氨酸(Tyrosine)： 1.它是腦中神經傳導物之一，可協助克服憂鬱、改善記憶。促進甲狀腺，腎上腺及腦下垂體之功能。 2.肉類中含有豐富的蛋白質，蛋白質其中的一種必需的氨基酸－酪氨酸(Tyrosine)經腸道吸收後，隨血液循環至腦部，會合成神經傳遞物－多巴氨〈Dopamin〉及正腎上腺素〈Norepinephrine〉， 3.此兩種物質都是負責思考敏捷及應付緊急狀況的重要物質。使血壓上升、體溫增加、精神興奮，睡意全消。 4.多巴胺、正腎上腺素和腎上腺素都是神經傳導因子。體內合成這些神經傳導因子的步驟，首先是一個反應速率控制的步驟，由酪胺酸 (tyrosine) 氫氧化成 L-多巴 (L-dopa)；接著L-多巴失去二氧化碳形成多巴胺 (dopamine)；多巴胺再氫氧化就生成正腎上腺素 (norepinephrene)；正腎上腺素可以再進一步甲基化變成腎上腺素 (epinephrene)。這些反應步驟都需要enzyme的催化。 （圖二）[2]

A.多巴胺被認為只是合成另一個神經傳導因子正腎上腺素的一個前驅物。他研發出一個具高敏感度的方法，可以分析多巴胺的量，結果發現多巴胺的量在腦部的某些區域，比正腎上腺素的量還要高，於是他推斷多巴胺本身也是一個神經傳導因子。腦部多巴胺的量特別高的區域是在基底神經節 ( basal ganglia)。

• 2000 年諾貝爾生理或醫學獎瑞典哥生堡 (Gothenburg) 大學的名譽退休教授卡爾生 Arvid Carlsson

B. 巴金森氏病 （Parkinson's disease）： 遺傳基因在巴金森氏病 ( Parkinson's disease, PD ) 的致病機轉上佔有重要的角色，是基於由家族性巴金森氏病所識別出的基因缺陷、同卵雙胞胎中巴金森氏病的盛行率的增加以及巴金森氏病發現有家族叢集 ( family clusters ) 的現象發生。在少數具有體染色體顯性遺傳及典型路易體 ( Lewy body, LB ) 病理特徵的巴金森氏病家族，從第 4 號染色體的長臂定位出㆒基因座稱為α-synuclein基因，並且從此基因辨識出許多突變。另一種引起體染色體隱性型式之幼年型巴金森氏病 ( ARJP ) 的基因，最近被發現為位於第 6 號染色體，致病的基因已被辨識並被命名為Parkin，此型態的巴金森氏病在病理學上不同於偶發性巴金森氏病( sporadic PD )，在其黑質 ( substantial nigra ) 組織中並未發現有 LB。第三個基因座亦發現於顯性遺傳之家族，其為晚發性並有典型的LB病理特徵，被定位出位於第二號染色體上 ( 2p13 )。迄今，仍未有證據顯示任何家族性巴金森氏症症候群的基因，在常見的偶發性巴金森氏病的致病機轉上扮演了直接的角色。為解釋偶發性巴金森氏病病患的致病原因，一項涉及易感基因(susceptibility gene ) 的理論被提出，用以解釋此疾病的遺傳組成。然而至目前為止，大部份的研究都無法確認特定的基因型與巴金森氏病具有關連性。 1.巴金森氏病 ( Parkinson's disease)，亦被稱為原發性巴金森氏症，臨床上主要的表徵為動作緩慢、肢體僵硬、靜止時的震顫、步態不穩，以及對 levodopa 的治療反應良好 1,2。巴金森氏病為一種進行性的神經退化性疾病，最終會導致殘廢及死亡。在台灣，約有二至三萬的巴金森氏病病患；但是到目前為止，這些患者僅能得到症狀上的治療。用於巴金森氏病治療的藥物，包括 L-dopa、多巴胺劑( dopamine agonist )、catechol-O-methyltransferase ( COMT ) 與 monoamine oxidase (MAO ) 抑制劑、amantadine 及抗激膽鹼性藥物(anticholinergic drug )。 巴金森氏病病理學的特徵為黑色素性神經元的喪失、黑質 ( substantial nigra; SN )的神經膠質過多 ( gliosis )、其他腦幹細胞核的色素沉著，以及在黑質殘存的神經元表現出路易體 ( Lewy body, LB ) 2.原發性巴金森氏病，可分為偶發性及家族性兩型；大部份的家族性的巴金森氏病以體染色體顯性遺傳為主，而臨床上的表現型 ( phenotype ) 和偶發性巴金森氏病患者難以區分 3.另一類的家族性巴金森氏病則為體染色體隱性遺傳，患者的發作年齡較早 4、造成巴金森氏病的真正機轉，至今仍未明顯，但最近的遺傳研究發現，遺傳基因在此疾病的致病機轉上佔有重要的角色。遺傳基因可能在巴金森氏病致病機轉佔有重要角色，是基於以下三點研究證據：(1) 流行病學的研究結果發現巴金森氏病有家族叢集 ( family clusters ) 的現象，同卵雙胞胎有較高罹患巴金森氏病的一致性(concordance rate )；及 (3) 由家族性巴金森氏病所識出基因缺陷的分子遺傳研究。本文主要藉由各種有關巴金森氏病之分子遺傳研究，做一回顧性的探討。 4.病例與對照組的研究(case-control study)： 最近許多病例與控制組研究均㆒致的顯示；巴金森氏病病患的家人及相關的親戚，罹患巴金森氏病的相關危險指數增加，且發病的頻率亦較高 5-9。約 6-30%的巴金森氏病病患，他們的第一或第二等血親亦有巴金森氏病的發生。以性別及年齡相符之社區成員所作控制組的研究亦發現，有巴金森氏病家族病史的個體，將來罹患巴金森氏病的危險性提高 2-14%。由於所有研究都來自運動障礙門診，被研究個體會有家族史的可能性較高、同時也比較容易察覺有家族史的存在，因此結果可能會有所偏差。雖然如此，保守性的評估巴金森氏病的第一等血親罹患巴金森氏病的相對危險性在 2-3 之倍間，此與在阿茲海默症的研究結果相近 10。 5.雙胞胎研究(twin study)： 大多數的早期雙胞胎研究顯示出同卵雙胞胎罹患巴金森氏病的一致率低 11-13，而這些結果通常被引用認為巴金森氏病與遺傳基因無關的佐證。然而以陽離子電腦斷層攝影 ( PET scan ) 檢查篩選在臨床上無巴金森氏病症狀的巴金森氏病雙胞胎個體的研究㆗發現，這些個體的黑質紋狀體多巴胺系統功能亦顯著的降低。此結果顯示，以PET 為診斷的基礎比臨床診斷做依據的雙胞胎研究，則有較高的一致率 14,15。最近 Piccini 以 PET研究家族型巴金森氏病的研究中發現，在一些臨床上無症狀的相關家屬，其 Fluorodopa PET 掃描顯示出有較高比率黑質功能的喪失 16。此研究證明巴金森氏病疾病患者黑質的退化程度遠比臨床上的表徵更為明顯。更有趣地是，在一大型解剖的研究中，臨床上沒有出現巴金森氏病臨床表徵的死亡個體，發現有多達 15% 的病例，其黑質細胞有輕度的喪失及 LB 表現。此研究顯示巴金森氏病的臨床前期 ( pre-clinical stage ) 患者的發生率可能遠大於出現臨床表徵的巴金森氏病的患者

6.巴病的主要病理變化是大腦內的黑質部(Substantia Nigra)的多巴氨神經細胞退化所致。此種細胞會分泌一種叫多巴胺的化學傳導物質﹐以及乙醯膽素這兩種物質平衡負責控制協調我們的運動功能而得以完成平穩﹑精細﹑複雜的動作。正常人隨著年齡的增長﹐多巴氨神經細胞的數量會逐漸減少﹐但是巴病患者減量的速度卻比一般人快許多。為細胞分泌的多巴氨濃度低於正常人的百分之八十時﹐臨床上就開始出現巴病症狀。

三、色氨酸(tryptophane) 1.色氨酸是人體必需的氨基酸之一，色氨酸會轉換成與調節睡眠有關的神經傳遞物質－血清素〈Serotonin〉使飯後產生飽足感及誘發睡眠。 2.血清素〈Serotonin〉:腦細胞會分泌一種俗稱快樂荷爾蒙的血清素(serotonin)，血清素的分泌代謝正常時，就會有足夠的抗壓及情緒調節能力，當人體處於黑暗的狀態下，腦內的血清素就會轉化為褪黑激素(melatonin)，由腦下垂體分泌出，如同一個指令般的吩咐人體進入睡眠狀態，這就是人們到了晚間，就會自然入眠的原因，一旦天亮了，人體在接受光照後，就會停止分泌褪黑激素，而白天的血清素分泌量也會比較高，讓人體有更多的活力迎接生活的挑戰。 精神疾病與腦神經內分泌、神經傳導介質相關。現今，西醫之精神神 經內分泌學中，最常提出的有：GABA（r-氨基丁酸）、ACTH （促腎上腺皮質激素）、Acetylcholine（乙醯膽鹼），與Choline（膽鹼）、Dopamin （多巴安）、Serotonin（血清素-5-羥色氨）、Melatonin（褪黑激素）、Prolactin（泌乳激素）、LH（在女性為黃體生成激素）、TSH（甲狀腺分泌激素）、GH（生長荷爾蒙）。在精神醫學界早期來講，都以T4 與TSH 來當研究對象，一直到哈里遜內科學，還是以T4 與TSH 之血中濃度為研究對象。大約十年前開始，至今，Serotonin 才成為研究對象。 Serotonin 異常所引起的症狀，比較接近中醫的甘麥大棗湯證，或是 黃連阿膠湯證、歸脾湯證、半夏厚朴湯證。Serotonin 是放鬆心情，寧心安神，像小孩在媽媽胸懷的感覺，影響睡眠的比較多，Serotonin 不足者較偏向甘麥大棗與半夏厚朴湯合方，或半夏天麻白朮湯加甘草、龍眼乾。過亢者屬知柏地黃湯、或柴胡龍骨牡蠣湯證。 Melatonin 是調整生理時鐘，即時差的適應，見到太陽下山就想睡覺； 或北極熊的冬眠皆與Melatonin 相關。在中醫較偏向於人參、十全大補、 右歸飲、腎氣丸、斑龍丸、各種核（堅）果、蛋黃、魚卵、肝的範圍。 Dopamin 不足的，較偏向補腎陽兼活血化瘀，甚者，更兼寒瘀，例如： 補陽還五湯或七保美髯丹加人參、川七、附子、乾薑、黃芩；或腎氣丸、 右歸丸、十全大補湯（人參、丹參同用）加鹿茸、川七、乾薑、附子、黃芩，用玉桂，或參附湯、補腎丸。過亢的屬陽亢或陽越。

（1）腦部的神經傳導物質─血清素（serotonin)的形成 ： 色胺酸(tryptophane) 由人體從食物攝取會先轉化為5-羥基色胺酸(5-Hydroxy Trptophan:5-HTP），然後進入腦細胞後，才會再轉化為情緒控制荷爾蒙─血清素(serotonin) <圖三> *Murch S.J.,KrishnaRaj S., Saxena P.K.(2000) Plant cell Reports 19,698-704

四、蛋白水解步驟： (a)鹼水解樣品100-125℃在空氣中16-20小時 (b)稀釋水解樣品(非冷卻的HCl)用層析buffer (c)將水解物澄清 (d)HPLC分離 (e)分光儀或氟儀器偵測

五、實驗步驟： 1.樣品製備：

   將絞碎蝦殼廢棄物在30℃發酵36h再經離心(沉澱物)得到幾丁質沉澱物和蛋白質液,將蛋白質液凝聚乾燥

2.萃取酪胺酸及色胺酸：

   從乾燥物品經酸雖水解,sample,25mg經(酸液水解)+超音波2min->0.5mg/ml

3. 水解蛋白：

  sample+4.2M NaOH(超音波兩分鐘)->去除N2加熱120℃ 4H->冷卻再用HCl調到pH9 , 在抽氣過濾 ,取液體加入borate buffer到50ml,取5ul進行HPLC分析 

六、Results and discussion A、HPLC separation and identification 最佳條件 a.Moblie phase：CH3OH:40mM sodium acetate buffer pH 4.5 (20:80) b.optimal wavelength: tyrosine:(λex = 274 nm ,λem = 304 nm) for 5.8 min tryptophan:(λex = 280 nm and λem = 348 nm) for 5.8 min Column temp:26℃ flow rate:0.80 mL/min column Exil ODS column with a particle size 5m

B、HPLC分析圖: <圖四>[3] Tryptophan peak 8.32 ±0.02min tyrosine peak 4.25±0.01min

C、Optimum conditions of alkaline hydrolysis of protein （圖五） 1. 以NaOH volume (3,6,9ml),hydrolysis time(4,8,12,16h)針對樣品25mg找最佳反應;NaOH濃度4.2N 2.These results indicated that 4 h of hydrolysis time at 9mL of 4.2N NaOH is adequate for complete hydrolysis of proteins, 3. 4 h of hydrolysis time and 3mL 4.2N NaOH were chosen for further works

D、方法確認： The relationship between concentrations and peak area were always linear, with coefficients of determination greater than 0.999. （圖六）

E、for the total of the tyrosine and tryptophan, was researched by analyzing the same sample, and the RSD was found to be 2.16% (3.83g/g dry mass, n = 8) for tryptophan and 1.86% (12.96g/g dry mass, n = 8) for tyrosine. The overall relative standard deviations (RSDs) （圖七）

F、presents the recovery percentages obtained to free tryptophan and tyrosine. During the recovery for total tryptophan and tyrosine, eight concentrated powdered protein samples from fermented shrimp waste were spiked with a known concentration (1.56 mg/g dry mass and 3.85 mg/g dry mass) before hydrolysis, extraction, and quantitation. The recovery for total tryptophan and tyrosine was 90.50% (7.38% RSD) and 95.9% (2.33% RSD), （圖八） G、Tryptophan and tyrosine (free and total) contents in a protein concentrate from fermented shrimp waste A、the tyrosine content was higher than the tryptophan contentcontent B、total tyrosine (10.78±2.00 mg/g dry mass) C、Total tryptophan (3.65±0.46 mg/g dry mass) in freeze-dried samples D、the tryptophan is a limiting factor in protein E、the free tyrosine and tryptophan mean contents were, respectively,approximately 67% and 74% F、the shrimp waste is deproteinized by proteolytic enzymes produced by the added microorganisms G、This is achieved during the enzymatic deproteinization of the shrimp waste by the action of the microorganisms （圖九） 七、Conclusions： HPLC偵測蝦殼廢棄物中protein的tryptophan & tyrosine為目前最簡單,快速,準確,可靠性,檢測樣品只需要少量的體積這方法應用生化及營養研究